Question

БИОЛОГИЯ ПОМОГИТЕ!!!!!!!!!!! ДАЮ 100 БАЛЛОВ

4. Далее с помощью протеазы вы удалили с вашего белка 6хHis- и SUMO-таги. В результате вы ожидали, что ваш белок X будет иметь молекулярную массу около 50 кДа. Но вы забыли добавить ДТТ в буфер. В результате последующей очистки белка на гель-фильтрации, позволяющей разделить белки и их комплексы по молекулярной массе, ваш белок элюировался двумя пиками, хотя вы ожидали один. Вы объединили фракции белка из каждого пика по отдельности. Чтобы разобраться с произошедшим, оба препарата вы пропустили через «ультраконцентраторы» — колонки, которые имеют две камеры и разделяющую их мембрану с порами, не пропускающими молекулы более 80 кДа. Вы нанесли образец в верхнюю камеру над мембраной и центрифугировали колонку, в результате часть раствора из верхней камеры («концентрат») перешла сквозь мембрану в нижнюю («проскок»). (рисунок 1)

Для дальнейшего анализа вы взяли по 1 мкл фракции нанесения до центрифугирования и по 1 мкл концентрата и проскока. Данные фракции вы проанализовали с помощью белкового электрофореза по Лэммли (в денатурирующих условиях в присутствии SDS и
β-меркаптоэтанола), результаты которого приведены на схеме. (рисунок 2)

Можно заметить, что белок из разных фракций имеет одинаковую молекулярную массу. Объясните, почему при гель-фильтрации белок сходит двумя пиками и почему отличаются результаты его пропускания через ультрафильтрационные колонки.

Answer 1

ультраконцентратор.

При гель-фильтрации белок может элюироваться двумя пиками из-за формирования агрегатов или комплексов с другими молекулами в буфере, особенно в отсутствие денатурирующих агентов, таких как ДТТ. Формирование этих комплексов может привести к изменению гидродинамического радиуса белка, что влияет на его элюцию и приводит к появлению двух пиков.

В случае ультраконцентраторов, которые имеют мембрану с порами, не пропускающими молекулы более 80 кДа, возможно, ваш белок образует комплексы с другими молекулами или структурами, которые превышают это ограничение молекулярной массы. Как результат, эти комплексы могут не пройти через мембрану, образуя "проскок". Однако, при анализе на белковом электрофорезе обнаруживается, что молекулярная масса белка в различных фракциях одинакова, что может указывать на то, что эти комплексы разрушаются в условиях электрофореза, и белок выходит в мономерном состоянии.